背景

　　脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，又稱內(nèi)毒素，為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，可作用于膜受體激活多種細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)的合成及釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。客戶采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立體外炎癥模型，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將蛋白及核酸從炎癥細(xì)胞中分離出來(lái)，從基因、蛋白相對(duì)表達(dá)水平方面評(píng)估羊棲菜多酚(Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs)的抗炎活性，為其在新型抑炎制劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.1羊棲菜多酚的制備

　　取干燥羊棲菜粉末，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，使用SCIENTZ-IID 超聲輔助浸提(料液比1:20(m/V)、50℃、60min)，抽濾后真空減壓蒸餾去除乙醇，獲羊棲菜粗多酚溶液，依次采用等體積石油醚、乙酸乙酯分級(jí)萃取，真空減壓蒸餾后凍干(使用 SCIENTZ-12N 過(guò)夜凍干)，獲得HFPs粉末。測(cè)得HFPs粉末總酚含量為23.67±0.24 mg/g。利用無(wú)菌水配制成多酚母液，再以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至不同濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2炎癥細(xì)胞培養(yǎng)

　　使用完全培養(yǎng)基(含10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)，細(xì)胞融合度約80%時(shí)進(jìn)行傳代。然后分成3組進(jìn)行培養(yǎng):①陰性對(duì)照組，僅加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;②LPS陽(yáng)性對(duì)照組，加入含LPS (1μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h;③HFPs+LPS組，經(jīng)含不同質(zhì)量濃度(10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350μg/mL)HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，以含LPS(1μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24h。

1.3RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

　　1.2中培養(yǎng)的三組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞2次，每孔加入500μL TRIzol試劑，使用SCIENTZ-IID加速破碎細(xì)胞協(xié)助提取總RNA，超聲參數(shù)為:100W，1s開(kāi)1s關(guān)，共1min，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Green嵌合熒光法與引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。測(cè)定目的基因(IL-1β、IL-6、TNF-a、COX-2、iNOS)和內(nèi)參基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1)Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4MAPKs、NF-KB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

　　1.2中培養(yǎng)的三組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞2次，加入200μL RIPA細(xì)胞裂解液，使用SCIENTZ-IID加速破碎細(xì)胞協(xié)助提取蛋白質(zhì)，超聲參數(shù)為:100W，1s開(kāi)1s關(guān)，共1min，離心(12000r/min、4℃)10min取上清液。采用BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，用蛋白上樣緩沖液調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為2mg/mL，95℃加熱10min使蛋白變性然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離;濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜;5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉(TBST溶液配制)封閉1h;一抗4℃孵育12h;二抗室溫孵育2h;加入ECL試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分別以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相應(yīng)蛋白磷酸化水平。

結(jié)果與分析

01RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果

　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定HFPs對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中重要促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-a基因相對(duì)表達(dá)量，以及炎癥相關(guān)酶COX-2基因相對(duì)表達(dá)量的影響。如圖1所示，LPS刺激不同時(shí)間后，所有炎癥介質(zhì)的mRNA表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)。HFPs對(duì)促炎細(xì)胞因子的抑制作用與其劑量、LPS誘導(dǎo)時(shí)間及細(xì)胞因子種類相關(guān)。與LPS組相比，靜息狀態(tài)細(xì)胞經(jīng)HFPs處理再經(jīng)LPS誘導(dǎo)12、24h后，IL-1β和IL-6的基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降;HFPs顯著抑制LPS誘導(dǎo)3h后TNF-a基因的相對(duì)表達(dá)，而在LPS誘導(dǎo)6~24h的抑制作用總體不明顯。在LPS誘導(dǎo)24h，較低劑量HFPs(30、60μg/mL) 預(yù)處理對(duì)COX-2基因表達(dá)具有顯著抑制作用，但提高劑量后該抑制效果消失，甚至出現(xiàn)反向促進(jìn)作用，120μg/mL HFPs預(yù)處理促使COX-2相對(duì)表達(dá)量較LPS組顯著上升(P<0.05).

02MAPKs、NF-KB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

　　1.2中培養(yǎng)的三組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞2次，加入200μL RIPA 細(xì)胞裂解液，使用SCIENTZ-IID加速破碎細(xì)胞協(xié)助提取蛋白質(zhì)，超聲參數(shù)為:100W，1s開(kāi)1s關(guān)，共1min，離心(12000r/min、4℃)10min取上清液。采用BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，用蛋白上樣緩沖液調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為2mg/mL，95℃加熱10min使蛋白變性然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離;濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜;5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉(TBST溶液配制)封閉1h;一抗4 ℃孵育12h;二抗室溫孵育2h;加入ECL試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分別以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相應(yīng)蛋白磷酸化水平。

總結(jié)

　　客戶采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立體外炎癥模型，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將蛋白及核酸從炎癥細(xì)胞中分離出來(lái)，從基因、蛋白相對(duì)表達(dá)水平方面評(píng)估羊棲菜多酚(Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs)的抗炎活性，為其在新型抑炎制劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中起到作用如下:

　　01輔助提取羊棲菜中多酚組分，加速多酚組分釋放，縮短了提取進(jìn)程，后續(xù)通過(guò)凍干步驟即可獲得羊棲菜多酚粉末，溶解后備用;

　　02搭配TRIzol試劑對(duì)細(xì)胞中總RNA進(jìn)行提取，試劑中含有苯酚，可加速細(xì)胞破碎和核酸釋放，還加入核酸酶抑制物質(zhì)防止RNA降解，PCR結(jié)果表明提取的RNA濃度與純度較好，可用于相關(guān)基因表達(dá)情況的分析;

　　03搭配RIPA裂解液對(duì)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，大幅減少原本冰上裂解所需時(shí)間(30 min)，試劑中含有的蛋白酶抑制劑可防止蛋白降解，還含有磷酸酶抑制劑，防止蛋白提取后的再修飾，更好測(cè)定蛋白磷酸化狀態(tài)。